原位杂交第三天1）用1ml含10%热灭清的MABT溶液置换溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，一小时以上，后用1mlMABT溶液置换，25分钟。2）用1ml1mM左旋米睉的Stainingbuffer洗三次，每次放置五分钟。3）将胚胎转入十六孔板中，吸去stainingbuffer，加上300ulBMPurpleAPSubstrate（底物，用之前加5mM左旋米唑），十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4%多聚甲醛固定，tunel检测服务，拍照。6）4C冰箱保存。染色体原位杂交实验的基本原理是利用特定标记的已知碱基序列的核酸探针，依据碱基互补配对原理，与中期染色体玻片标本中的同源DNA序列进行杂交。标记可以用放1射性同位素（3H、35S、32P），然后进行放1射自显影；也可以用非放1射性的荧光素生物素、地1高辛，再用荧光显微镜进行观察，即荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridization，FISH）技术。阻断内源性过氧化物酶：滴加3%1甲1醇-H2O2，室温避光孵育15min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。预杂交：滴加预杂交液，37°C孵育1h。杂交：倾去预杂交液，滴加含探针has-circ-ST6GALNAC6probe杂交液，浓度6ng/ul，恒温箱37度杂交过夜。杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37°C洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。滴加封闭液：滴加封闭血1清（正常兔血1清），室温30min。滴加鼠抗地1高辛标记过氧化物酶（anti-DIG-HRP）：倾去封闭液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育50min，后PBS洗3次×5min。科锐诺生物-tunel检测服务由武汉科锐诺生物科技有限公司提供。“外泌体,透射电镜,扫描电镜,石蜡切片等技术服务”选择武汉科锐诺生物科技有限公司，公司位于：湖北省武汉市江夏区神墩四路666号武汉国英种子A栋1楼，多年来，科锐诺坚持为客户提供好的服务，联系人：王经理。欢迎广大新老客户来电，来函，亲临指导，洽谈业务。科锐诺期待成为您的长期合作伙伴！)